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实验室离心机在蛋白表达系统中作用分析

发布时间:2022-09-27 17:58:29??????点击:

  蛋白表达的相关研究中可以看到离心机起到了重要作用。

  体外重组蛋白表达有四大系统:大肠杆菌表达系统,哺乳动物细胞表达,酵母表达系统及昆虫细胞表达。

  今天我们要详细讲一下大肠杆菌表达系统。

  先从大肠杆菌表达系统步骤了解:

  不包括基因构建等上游操作和蛋白纯化部分。基因构建参考密码子优化,蛋白纯化参考蛋白纯化专题。以下内容主要包括蛋白表达鉴定:

  表达鉴定第一天的任务,常用抗性选择根据感受态细胞选择拿到质粒,实验室离心机离心(3000r/min;2min)在质粒中加入TE(使质粒最终加入到110μL感受态细胞中的量为80-100ng,据此确定加入TE的量),一般为(1μg质粒加20μLTE;2μg质粒加50μLTE;5μg质粒加100μL TE)将质粒与TE混匀,加入2μL混液于感受态细胞中将感受态细胞放入冰箱(4℃)中,30min取出后立即放入水浴锅中(42℃),热激90s,再次放入冰箱(4℃)中,3min拿出后取200μL的LB液体培养基加入到已转入质粒的感受态细胞中放入摇床(37℃;  195r)中,  30nim至60min; (最佳45min)取出离心(3000r/min;2min)去掉200μL的上清,留100μL左右上清悬浮沉淀,吸取50μL悬液涂平板,(先将对应抗性的平板放入培养箱(37℃)中预热20min)把平板放入培养箱(37℃),过夜(12h至16h)。

  其次是表达鉴定第二天的任务,注意Pcold的表达温度:

  每个平板挑取单菌落至4支对应抗性的L(4ml)试管中,编号为“0”“1”“2”“3”。

  将试管放入摇床(37℃;195r)中,(单抗3h左右;双抗4左右;刚开始用可见分光光度计测OD值;熟练后可目测(背光下,以试管中的枪头为例,刚刚看不见枪头即可)),测OD值(0.6至0.8)。

  从“0”号管中取700μL悬液加入到100μL(C=80%)的保种甘油中,震匀,放入冰箱(-20℃)冻存。

  在每组菌的“1”“2”“3”号试管中分别加入2μL的IPTG(终浓度0.5mM最适)。

  视不同的载体选择适合的表达环境(PET/PGEX:15℃表达过夜;25℃表达6h;37℃表达3h至4h(4支试管,“0”“1”号试管15℃表达过夜;“2”“3”试管37℃表达3h至4h)。Pcold:全部15℃表达过夜)。

  最后是表达鉴定第三天,全菌的表达鉴定分析,注意控制溶质的量及溶液黏度:

  从每组4支的试管中均取500μL菌液加入到1.5ml离心管中,(若OD值不一样,值小的可多取)离心(6000r/min),5min, 去上清,留沉淀(沉淀少的,可再取菌液离心,尽量使沉淀量接近)。

  在每个离心管中加入500μL的DDH2O,悬浮沉淀,离心(6000r/min),5min, 去上清,留沉淀。

  在每支离心管中加入45μL的1×PBS和45μL的2×Loading Buffer悬浮沉淀(当溶质适量且均一的情况下,加入量不变;当溶质多且粘稠时,应使加入量增大,为降低粘度也可减少上液量)。

  放入煮样器(100℃) 25min。

  取出后离心(6000r/min)  3min,  电泳检测。

  从上述详细步骤可以看出实验室离心机在整个过程中都不能缺席。


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